Pengujian antimikroba dapat dilakukan dengan dua metode yaitu metode difusi dan dilusi, metode difusi atau diffusion test untuk menentukan daya hambat dari bahan antimikroba, sedangkan metode dilusi dillution test digunakan untuk mengetahui MIC (Minimum Inhibitory Concentration) dan MBC (Minimum Bactericidal Concentration) pada bahan antimikroba. MIC merupakan konsentrasi terendah bahan antimikroba yang dapat menghambat pertumbuhan sedangkan, MBC adalah konsentrasi terendah bahan antimikroba yang dapat membunuh mikroba.
Metode difusi yang sering digunakan yaitu metode difusi kertas cakram (Paper dish) dan metode difusi sumur. Metode difusi agar memiliki kelebihan yaitu sederhana untuk dilakukan dan dapat digunakan untuk melihat sensitivitas berbagai jenis mikroba terhadap antimikroba pada konsentrasi tertentu. Kekurangan dari metode difusi agar adalah senyawa antimikroba yang akan di uji harus bersifat hidrofilik agar dapat berdifusi dengan baik kedalam agar.
Mekanisme kerja metode difusi secara umum yaitu komponen antimikroba akan berdifusi kedalam agar dan menghambat pertumbuhan mikroba yang terkandung dalam agar. Metode sumur dilakukan dengan membuat sumur berdiameter 6 mm pada media agar yang telah ditambahkan bakteri uji. Sumuran yang telah dibuat diisi dengan komponen antimikroba selanjutnya dimasukan kedalam refrigerator untuk memberi kesempatan senyawa berpenetrasi sebelum dilakukan inkubasi. Setelah inkubasi selama suhu 37 derajat celcius selama 24 jam dilakukan pengamatan dan pengukuran zona pengamatan dan pengukuran zona penghambatan pertumbuhan mikroba (mm).
